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協(xié)合醫(yī)院細胞培養(yǎng)--液氮貯存桶

發(fā)布時間：2017/12/28 18:15:59    關(guān)注量：1354
細胞培養(yǎng)的一般過程，主要包括準備、取材、培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇4步。為保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。  
凍存的溫度一般用一196℃液氮溫度，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。  
目前美國標準細胞庫或細胞銀行，其中包括來自正常人和各種疾病患者的皮膚成纖維細胞系和來自不同物種的近75個雜交瘤細胞株。  
1．目的：  
為了保證培養(yǎng)細胞的正常生長，實驗技術(shù)人員必須明確并正確執(zhí)行細胞培養(yǎng)的基本操作步驟，特制訂實驗室細胞培養(yǎng)操作流程。  
2．適用范圍：  
適用于來我院細胞室進行細胞培養(yǎng)工作的人員。  
3．操作規(guī)程：  
3.1  培養(yǎng)液、PBS、胰蛋白酶的配制  
3.1.1   1000ml培養(yǎng)液的配制  
1、準備用品：培養(yǎng)粉、1000ml燒杯、玻棒、量筒、電子分析天平、PH儀、2～3天內(nèi)的新鮮三蒸水（或新鮮反滲水）、NaHCO3粉、1000ml無菌玻璃瓶（100ml×10個玻璃瓶）、青霉素、鏈霉素、2～3個過濾器、注射器。紫外線照臺30min。  
2、將培養(yǎng)粉用900ml新鮮三蒸水（或新鮮反滲水）溶解，并沖洗袋內(nèi)殘留粉末。  
3、充分攪拌，按說明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分攪拌。無需加谷氨酰胺，因該培養(yǎng)基里已含有。  
4、用1M（1mol/L）HCl調(diào)PH至7.0左右（細胞適宜在PH7.2～7.4生長，配制好后PH值會升高0.2～0.3，故配時調(diào)PH至7.0左右）。  
5、用新鮮三蒸水（或新鮮反滲水）定容到1000ml。  
6、配青霉素80萬/瓶+4ml蒸餾水溶解  
配鏈霉素100萬/瓶+4ml蒸餾水溶解  
取0.5ml青霉素和0.4ml鏈霉素加入到1000ml培養(yǎng)液中，使其終濃度均為100U/ml，充分攪拌混勻。  
7、在無菌操作臺里用0.22um的除菌濾膜過濾配制好的培養(yǎng)液，并分裝到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，蓋上橡皮塞，放-20℃保存?zhèn)溆谩? 
注意：  
（1）配制培養(yǎng)液及調(diào)節(jié)培養(yǎng)液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鮮三蒸水（或新鮮反滲水）配制。  
一般于配制當(dāng)天制備，以保證水的純度和質(zhì)量。  
（2）準備的100ml×10個玻璃瓶必須事先高壓滅菌！燒杯、量筒、玻棒、盛新鮮三蒸水（或新鮮反滲  
水）的容器均不需高壓滅菌，干凈即可。  
3.1.2PBS（平衡鹽溶液）的配制  
NaCl8g  
KCl0.2g＋新鮮三蒸水（或新鮮反滲水）至1000ml  
Na2HPO4*H2O1.56g  
KH2PO40.2g  
3.2細胞復(fù)蘇  
1、準備：紫外線照臺30min，準備好裝有高壓滅菌好的吸管、試管的飯盒、廢液缸；培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘。在操作臺上擺放好物品，左邊為飯盒、培養(yǎng)液等，中間為酒精燈、試管架等，右邊放滴管架、鑷子，右上角放廢液缸。  
2、灼燒培養(yǎng)瓶口及瓶蓋，用滴管取培養(yǎng)基5ml加入試管中（一滴約為50ul）。  
3、戴手套，從-196℃液氮罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，保證凍存管內(nèi)細胞1min內(nèi)融化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。（慢凍快融）  
4、用吸細胞液的滴管從凍存管中完全吸出細胞懸液，加入到已裝有培養(yǎng)基的試管中，塞子塞試管，800rpm離心2min（用培養(yǎng)基且離心的目的:去除細胞冷凍保護劑DMSO，因常溫下其對細胞毒性大），棄上清，試管底部的白色物質(zhì)為細胞，輕彈混勻。往試管中加培養(yǎng)基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS濃度為20％）。用吸細胞液的滴管輕輕吹打，使細胞混勻，以免在培養(yǎng)瓶里成團，影響細胞生長。  
5、將試管中的細胞懸液用吸細胞液的滴管全部吸出，加到培養(yǎng)瓶中，標記日期、細胞名稱，再把培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱。（注意：加入到培養(yǎng)瓶后，培養(yǎng)瓶輕輕平放，用手拿培養(yǎng)瓶側(cè)壁，左右上下輕輕搖晃幾次，使細胞均勻貼壁在培養(yǎng)瓶底。）  
6、收拾所用物品、用75%酒精噴灑操作臺，擦臺，保持臺面整潔。  
注意：  
（1）入細胞室前觀察CO2%壓力，5-7.5mPa左右，減壓器表壓力不低于0.1mPa！  
（2）剛復(fù)蘇的細胞需要的營養(yǎng)成分更多些，讓FBS濃度達到20％。  
（3）離心時間為1～2min，速度為800轉(zhuǎn)，不要離心太久，避免對細胞傷害較大。  
（4）滴管使用注意事項：  
a.吸細胞液專用一個滴管，各株細胞的滴管一定要嚴格分開，不能混用，防止細胞間污染。  
b.培養(yǎng)基和FBS（胎牛血清）可以用一個滴管，但分開用更好！  
c.FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,因為血清對胰酶活性有抑制作用。  
d．胰酶和PBS（平衡鹽溶液）可以用一根滴管，不過最好分開  
（5）不是所有的細胞復(fù)蘇后都能活。死亡原因：凍存時間太長（如2年以上），技術(shù)不過關(guān)（如吹打太激烈）、細胞傳代數(shù)太多等。  
（6）關(guān)于PBS（平衡鹽溶液）:  
a.PBS溶液配好后要高壓滅菌后才能用；PBS高壓時其瓶塞一定要插針頭。  
b.PBS和培養(yǎng)基都可以沖洗培養(yǎng)瓶里細胞中的雜質(zhì)，但需用溫過的PBS沖洗細胞中的雜質(zhì)。PBS雖然沖洗雜質(zhì)效果較好，但它有使細胞易脫壁的傾向，故不可經(jīng)常沖洗細胞。  
c．不溫的PBS用來做難消化細胞消化前沖洗一遍的準備，使細胞加入胰酶后易消化。  
d．消化后暫時不養(yǎng)細胞的培養(yǎng)瓶，可以往其中加入2～3mlPBS（防止培養(yǎng)瓶干燥），培養(yǎng)瓶放CO2培養(yǎng)箱里短時間保存。下次用該培養(yǎng)瓶再養(yǎng)同種細胞時，把PBS吸出棄去，再用培養(yǎng)基沖洗一遍即可再用。  
（7）DMSO（二甲基亞砜）在常溫下對細胞毒性較大，而在4℃時，其毒性大大減弱，故凍存的細胞復(fù)蘇后應(yīng)及時洗滌冷凍保護劑DMSO（離心后棄去上清），防止DMSO在常溫下對細胞產(chǎn)生較大毒性！  
3.3細胞換液  
1、倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)：  
a.移動細胞培養(yǎng)瓶時，觀察到呈漂浮狀態(tài)的細胞為死細胞；  
b.生長狀態(tài)良好的細胞：透明度大、折光性強、輪廓不清；能看清部分細胞細微結(jié)構(gòu)，細胞處于對數(shù)生長期時可以見到很多分裂期細胞。  
c.生長狀態(tài)不良的細胞:細胞折光性變?nèi)?，輪廓增強，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴、顆粒樣物質(zhì)，細胞間空隙加大，細胞變得不規(guī)則，失去原有特點。  
d.只有生長狀態(tài)良好的細胞才適合進一步傳代和實驗。  
2、紫外線照臺30min，準備好吸管、試管飯盒，溫育培養(yǎng)基，F(xiàn)BS（胎牛血清）可不溫。實驗開始時打開照明燈和抽風(fēng)機，用75%酒精噴雙手。酒精燈點燃放中間。滴管放滴管架上，從左到右順序為：吸細胞液的滴管、吸培養(yǎng)基的滴管、吸FBS（胎牛血清）的滴管。從水浴箱中取出培養(yǎng)基，擦干水放入操作臺的左邊。  
3、從CO2培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)瓶，在酒精燈外焰上旋轉(zhuǎn)灼燒其瓶口、蓋子處（注意不要把膠蓋燒焦），滴管（前端90%部位）灼燒。細胞培養(yǎng)瓶傾斜，用吸細胞液的滴管吸出舊液棄到廢液碗中，盡量吸干凈。注意：滴管的膠頭應(yīng)在瓶外壓緊再伸進培養(yǎng)瓶內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡，且不要伸入瓶內(nèi)太多，防止造成污染；滴管尖端懸空棄液，不要觸到廢液碗（要親眼看到棄液，防止滴管尖端觸到廢液碗）！  
4、用吸培養(yǎng)基的滴管吸取培養(yǎng)基90滴加入到培養(yǎng)瓶（25c㎡）中，再用吸FBS（胎牛血清）的滴管吸取FBS10滴加入到培養(yǎng)瓶中。（使FBS濃度為10％）  
5、旋緊細胞培養(yǎng)瓶蓋后，再旋回半圈，以利于空氣流通。平放回CO2培養(yǎng)箱中。  
6、收拾所用物品、用75%酒精噴灑操作臺，擦臺，保持臺面整潔。  
注意:  
（1）在打開培養(yǎng)基、FBS（胎牛血清）、培養(yǎng)瓶前后均需旋轉(zhuǎn)灼燒其瓶口和瓶蓋，嚴格注意無菌操作。滅菌飯盒只能在無菌操作臺里打開。  
（2）鑷子每次使用前均需灼燒。裝FBS的瓶子瓶蓋小，用鑷子夾住蓋子灼燒后，再用其夾住瓶蓋蓋上；取其瓶蓋時也是用鑷子夾住瓶蓋取下蓋子。  
（3）滴管在第一次使用前也需灼燒。注意：除吸取細胞液的滴管外，其他滴管滴加液體時都要懸空滴加。已吸過液體的滴管在再次使用前決不能再灼燒！滴管千萬不能混用！  
（4）培養(yǎng)瓶口不要對著自己，不加試劑時要平放。  
（5）培養(yǎng)液以沒過細胞為宜。  
（6）細胞液顏色變黃，死細胞多時換液。不要求每天換液，容易增加污染機會。

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    在維修氣相色譜儀儀器的過程中，首先一定要注意安全和注意保護環(huán)境。氣相色譜儀維修中可能造成安全事故與環(huán)境污染的因素大致如下所述： A.氫氣泄漏造成爆炸、燃燒等安全事故。 B.電子捕獲放射源造成人體傷害、環(huán)境污染事故。 C.易燃易爆、有毒、腐蝕性等危險性樣品造成安全事故、人體傷害、環(huán)境污染事故。 D.高電壓、大電流造成觸電事故。 E.高溫造成的燙傷事故。 F.其他說明書上已有描述的相關(guān)注意事項。 上述...

  • 色譜行業(yè)銷售：如何讓客戶不掛你電話？

    做銷售的應(yīng)該都經(jīng)歷過給客戶打電話，但是往往你剛剛開口說話，對方就掛了電話，這是什么原因呢？怎樣才能讓客戶不掛你電話呢？ 需要注意的是： 在電話剛接通開始的10秒鐘和你說的前三句話，決定了客戶是否掛你電話。 首先，想想你之前掛的一些營銷電話，他們有什么共同特征？ 一聽就知道是推銷的（推銷口吻太重，開口就問對方買不買） 說了一大堆不知道說的什么 自己說自己的，不管客戶在干嘛 所以第一步我們要避開這種情...

  • 關(guān)于氣相色譜儀器的保護

    在維修氣相色譜儀器的過程中，要注意按規(guī)范認真仔細地操作，避免損壞氣相色譜儀器，造成新的故障或?qū)⒐收蠑U大。應(yīng)該注意的內(nèi)容如下所述： 1.已安裝色譜柱的儀器，在通電之前應(yīng)先通入載氣，一般來說，載氣對保護儀器是有利的。 2.熱導(dǎo)檢測器必須先通載氣，然后才能加電流，否則可能燒斷鎢絲。熱導(dǎo)檢測器還必須防止氧氣、空氣進入，否則可能造成鎢絲氧化。 3.電子捕獲檢測器必須防止氧氣、空氣、雜質(zhì)進入，否則極易污染。 ...

  • 如何確定色譜柱老化是否完全?

    溫馨提示：拿到氣相色譜柱，在進行檢測之前，必須要進行老化！FID檢測器最適合用于檢測色譜柱老化時的基線。在升溫程序的末端，基線將升高，然后基線下降逐漸平穩(wěn)，此時可以認為色譜柱老化完成。　 當(dāng)色譜柱處于高溫時，柱壽命急劇下降。如果色譜柱老化時超過2小時還有大量柱流失，則將色譜柱冷卻至室溫，辨認柱流失來源如：氧氣滲入、隔墊漏氣和儀器本身的殘留物。 柱流失：在色譜柱老化之后做柱流失實驗，不進樣跑一次程序...

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